|
RR0701产品组分 |
100T |
|
KEIris 5× RT All-in-One Mix |
400 µL |
|
dsDNase |
2×50 µL |
|
RNase-free water |
2×1 mL |
* KEIris 5× RT All-in-One Mix包含以下组分：逆转录酶，RNA酶抑制剂，dNTPs, buffer，Oligo(dT)20VN 和随机引物。
KEIris RT mix with dsDNase（All-in-One）是将 RNA 合成cDNA 的一个操作更为简便的系统，含有第一链 cDNA 合成所需的全部试剂，仅需加入 RNA 模板和水即可进行逆转录反应，操作非常方便。使用该逆转录预混液 15 分钟内最长可获得12 kb 大小的cDNA。合成的cDNA 推荐用于qPCR 反应。
该预混液采用特制的高效 dsDNase，该酶具有热敏感性， 可在高温条件下快速不可逆地失活，因此仅需一次加样，即可同管进行去除基因组 DNA 污染与逆转录反应，与使用DNase I 去除基因组 DNA 污染相比，无需额外加入 EDTA 进行失活，不仅减少了对 RNA 模板的损伤、降低 RNase 污染风险，而且节省实验时间。
1.在冰浴的无核酸酶的离心管中配制下列逆转录体系:
|
组分 |
体积 |
|
KEIris 5× RT All-in-One Mix |
4 μL |
|
dsDNase |
1 μL |
|
模板 RNA |
50 ng～1 μg |
|
RNase-free water |
加至 20 μL |
2.轻轻混匀，瞬时离心（使液体沉于底部）
3.在PCR仪上进行下列条件的反应：
37℃，温育 2 min，以去除基因组 DNA污染；
55℃，温育 15 min；
85℃，孵育 5 min，以终止反应
4.将获得的产物迅速置于冰上或立即保存于-20℃，用于后续实验。
1.RNA 模板的纯度和完整性是影响逆转录效果的重要因素， 如模板中含有蛋白、EDTA、酚等杂质会使 RNA 降解。
2.若后续实验为 qPCR，逆转录产物的加量应不超过 PCR 体系终体积的 1/10，如 20 μL 的 PCR 反应体系，逆转录产物的加量应不超过 2 μL。
3.预混液中已经包含 Oligo(dT)20VN 和随机引物，不仅适用于包含 Poly(A) 结构的真核生物 mRNA，也适用于不含Poly(A)结构的原核生物 RNA、真核生物 rRNA 和 tRNA 等模板，但不适用于 miRNA 等小 RNA 模板。
*储存于-20℃，有效期一年。
