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组分 |
50T |
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Super Fusion Cloning Mix (2×) |
250 μL |
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Control Plasmid, linearized (50 ng/μL) |
5 μL |
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500 bp Control Fragment (50 ng/μL) |
5 μL |
*微量体积试剂请在正式实验开始前进行瞬时离心操作
无缝克隆是一种简单、快速并且高效的 DNA 定向克隆技术，可将插入片段定向克隆至任意载体的任意位点。 通过识别 DNA 片段和线性化载体末端的 15-25 bp 同源序列，50℃反应 15-60 min 即可将 DNA 片段和线性化载体高效精确地融合在一起， 完成定向克隆，且克隆阳性率可达 95%以上。
1.简单、快速、高效， 可将插入片段克隆至任意线性载体的任意位点；
2.不依赖于连接酶，无载体自连，阳性率可达 95%以上；
3.无需考虑插入片段自身携带的酶切位点；
4.一次反应可完成单至多个片段重组。
流程概要图：
选择合适的克隆位点，对载体进行线性化，线性化载体可以通过酶切或者反向 PCR 扩增完成。
1、酶切制备
双酶切：线性化完全，转化背景（假阳性克隆）低；
单酶切：线性化程度差，可通过适当延长酶切时间来减少环状质粒的残留。
注： （1）双酶切无需去磷酸化，单酶切需要去磷酸化；
（2）酶切完成后，应将快速内切酶失活或对目的产物纯化后再用于重组反应。
2、反向PCR 扩增制备
载体质粒 DNA 为模板，克隆位点为分界点，设计一对反向引物，推荐使用高保真 PCR Mix 进行扩增。
PCR 引物的 5’端必须包含与其相邻片段（插入片段或载体）末端同源的 15~25 nt（推荐 18 nt）序列。假如载体为粘性末端，且 3’端突出，则引物设计必须包含突出部分；若5’端突出，则引物设计可以包含突出部分，也可以不包含。
插入片段扩增引物：
5’—上游载体末端同源序列+酶切位点（可选）+基因特异性正向扩增序列—3’
3’—基因特异性反向扩增序列+酶切位点（可选）+下游载体末端同源序列—5’
注：尽量选择无重复序列且 GC 含量均匀的区域进行克隆，当载体克隆位点上下游 25 nt 区域内 GC 含量为 40~60%时，重组效率最高。
插入片段可用任意 PCR 酶 (Taq 酶或高保真酶) 扩增， 无需考虑产物末端有无 A 尾 (重组过程中将被去除， 在最终质粒中不会出现)。 建议使用高保真聚合酶进行扩增以减少扩增突变的发生。建议使用纯化后的 PCR 产物进行无缝克隆反应，若 PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定为特异性扩增产物，可直接可用于无缝克隆反应，但加样的体积不宜超过反应总体积的 20% 。
